潮霉素B的作用机理及生物应用究竟有哪些？

潮霉素B Hygromycin B是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。潮霉素B通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因的原核或真核细胞。　　对潮霉素B Hygromycin B的抗性基因：

　　对潮霉素B的抗性源自编码潮霉素B磷酸转移酶(Hph)的基因。至今发现两种来源：

　　1.Streptomyces hygroscopicus产生的Hph抗性基因;

　　2.Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae内质粒携带的Hph抗性基因(常用);

　　潮霉素B Hygromycin B的生物应用：

　　1) 筛选和维持培养稳定转染Hph+载体的原核细胞或真核细胞(植物细胞和哺乳动物细胞);

　　2) 由于作用模式的差异，常与G418 (GeneticinTM)，Zeocin 和blasticidin S联合使用，筛选稳定转染两个不同载体的细胞株;

　　3)抗病毒剂，由于潮霉素B选择性渗透进入病毒感染增强通透性的细胞，而且具有抑制翻译的功效;

　　4)作为驱虫药加入动物饲料;

　　应用浓度：

　　潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型，培养基，生长条件和细胞代谢率而变化。推荐使用浓度为50-1000 μg/mL，浓度需要杀灭曲线来确定。

　　哺乳动物细胞·200-500 μg/mL;细菌/植物细胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000 μg/mL;

　　潮霉素B Hygromycin B的两种使用方法如下：

　　使用一：杀灭曲线确定杀死浓度(仅作参考，因个人检测体系而异)

　　(1)往组织培养级的96孔板内加入未转染细胞，细胞密度约50-200细胞/孔;细胞贴壁之后，往每孔加入含不同浓度(如50-1000μg/mL，至少5个浓度)潮霉素B的200μL新鲜培养基;

　　(2)37℃，5% CO2培养箱孵育细胞10-14天;

　　(3)培养5-7天后更换新的培养液，培养液内含有相应浓度的潮霉素B;

　　(4)10-14天后使用细胞增殖方法如MTT，CCK-8等评估细胞活力;也可以通过检测细胞克隆数或百分比汇合率来确定毒性效应。一般选择在10-14天能够杀死所有细胞的小浓度为筛选浓度。

　　使用二：筛选稳定转染细胞

　　(1) 对于贴壁细胞，直接吸去60mm培养皿内的转染细胞培养基，然后加入含有潮霉素B的新鲜培养基5-6ml;对于悬浮细胞，无菌条件250x g,离心10min除去旧的转染细胞培养基，然后悬浮在约5ml的含潮霉素B的新鲜培养基;

　　(2) 5-7天后，如上方法更换含有潮霉素B的新鲜培养基;

　　(3) 再孵育细胞5-7天;

　　(4) 10-14天孵育后，培养体系中只含有能够表达潮霉素B抗性表型的活细胞。因此筛选之后如步骤一，更换不含潮霉素B的新鲜培养基。